Seminar tháng 10

Nhóm thực hiện: Phạm Ngọc Hà
Trần Thị Ngọc Quỳnh
Giáo viên hướng dẫn: Ks. Nguyễn Văn Lẫm

Nội dung:

I.Tổng quan về Azotobacterium
II.Mục tiêu đề tài
III.Vật liệu- phương pháp
IV.Tài liệu tham khảo
I.Tổng quan về Azotobacterium
•Azotobacterium là vi khuẩn cố định N sống tự do trong đất.
•Được phân lập và nuôi cấy thuần khiết từ năm 1901 do nhà VSV Hà Lan Beijerinck.

1. Hình dạng, cấu tạo
•Khi còn non tế bào có dạng que đầu tròn đứng riêng lẻ hay xếp thành từng đôi chồng chất, chất tế bào nhuộm màu đồng đều, có khả năng di động nhờ tiêm mao.
•Kích thước: 2,0-7,0 × 10-25 µm
• Khi già tế bào Azotobacter mất khả năng di động, kích thước thu nhỏ lại biến thành dạng hình cầu.
• Vi khuẩn Gram âm không sinh bào tử
• Vi khuẩn thuộc loại hiếu khí nhưng có thể phát triển được trong điều kiện vi hiếu khí.
• Hình dạng tế bào Azotobacter và chu kì biến đổi của chúng phụ thuộc vào tuổi của ống giống và điều kiện phát triển.

Phân loại
Theo Becking (1974), Azotobacter có 4 loài: A.chroococcum; A. beijerinckii; A.vinelandii; A.agilis.
ü Azotobacter chrococcum
• Kích thước tế bào 2,0 x 3,1µm.
• Có khả năng tạo nang xác, có khả năng di động được, có tiêm mao.
• Khuẩn lạc khi già có màu nâu đen, sắc tố không khuếch tán vào môi trường.
• Có khả năng đồng hóa mannit, ramnose, tinh bột.
ü Azotobacter beijerinskii
• Kích thước tế bào 2,4 x 5,0µm.
• Có khả năng tạo nang xác, không có tiêm mao, không di động được.
• Khi già có màu vàng hoặc màu nâu sáng. Sắc tố không khuếch tán vào môi trường.
• Có khả năng đồng hóa mannit, ramnose, không đồng hóa tinh bột nhưng đồng hóa được benzoat natri.
ü Azotobacter vinelandii
• Kích thước 1,5 x 3,4µm.
• Có khả năng tạo nang xác, có tiên mao, có khả năng di động.
• Sinh sắc tố màu vàng lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào môi trường.
• Có khả năng đồng hóa mannit, ramnose, benzoat natri.

Đặc điểm sinh lý
• Trong điều kiện không có Nitơ Azotobacter sẽ dùng Nitơ của không khí để biến thành hợp chất Nitơ của cơ thể sống.
• Trong điều kiện thích hợp cứ mỗi khi tiêu thụ 1gam hydratcarbon Azotobacter có thể cố định được 10- 15mg Nitơ.
• Trên các môi trường không chứa Nitơ khuẩn lạc Azotobacter có dạng nhầy, lồi, đôi khi nhãn nheo.
• Azotobacter sử dụng nhiều loại hợp chất hữu cơ khác nhau: disacarit, dextrin, tinh bột, acid hữu cơ, hợp chất thơm, …
• Một số chủng Azotobacter không có khả năng đồng hoá lactose, manitol hoặc natribenzoat.
• Có khả năng đồng hoá muối amonium, urê. Một số chủng Azotobacter có khả năng sử dụng nitrit, nitrat. Hai loại acid amin thích hợp nhất đối với nhu cầu dinh dưỡng
của Azotobacter
• Không có khả năng đồng hóa chất mùn, phát triển mạnh ở môi trường giàu chất hữu cơ dễ đồng hóa (đất có bón phân xanh, phân chuồng, rơm rạ).
• Đồng hóa rất tốt các sản phẩm phân giải của cenlulose.
• Azotobacter mẫn cảm cao đối với phospho, canxi.
• Mẫn cảm với pH, phát triển ở pH=4,5–9,0, thích hợp nhất là pH = 7,2 – 8,2.
• Đòi hỏi độ ẩm rất cao của đất, thích hợp:75- 80%.
• Nhiệt độ thích hợp 25 – 300C, nhưng Azotobacter có khả năng chống chịu tốt ở nhiệt độ thấp.
• Có khả năng tiết ra các loại vitamin và các chất sinh học như: B1, B6,... axit nicotinic, axit pentotenic, biotin, auxin.
• Có khả năng tiết kháng sinh để chống nấm thuộc nhóm Anixomixin. Một số chủng A.chroococum có khả năng sinh ra một số chất chống nấm (Aspergillus,
Penicillium, Fusarium, Alternaria …)
. Ứng dụng

• Sản xuất ở quy mô công nghiệp hoặc thủ công nghiệp những chế phẩm Azotobacter và gọi là azotobacterin. Đó là những dịch nuôi cấy Azotobacter được hấp thụ vào than bùn hoặc các loại đất giàu chất hữu cơ đã trung hoà và bổ sung thêm một ít phân phospho, kali…
• Hiệu quả hơn đối với các đất giàu chất hữu cơ hoặc được bón thêm nhiều phân khoáng.
• Ngoài ra còn khai thác khía cạnh tổng hợp các chất hoạt động sinh học kích thích sinh trưởng của cây trồng .
• Ở Việt Nam, việc sản xuất và sử dụng chế phẩm azotobacterin chỉ đặt ra trong những điều kiện thâm canh có khả năng dồi dào về phân bón, cần bón vôi và bón phân lân để làm tăng số lượng Azotobacter trong đất.
II. Mục tiêu đề tài
• Azotobacter là vi khuẩn có khả năng cốđịnh Nitơ sống tự do trong đất, có khả năng sản sinh vitamin (B1, B2,piridoxin, nicitinic,..), các chất kích thích sinh trưởng thực vật ( IAA, acid gibberellic).
• Tìm ra chủng Azotobacter, xác định các giống có khả năng cố định Nitơ mạnh, giữ giống và nhân giống phục vụ cho các mục tiêu khác.

III. Vật liệu-phương pháp
1. Vật liệu
*Môi trường nuôi cấy (Ashby(g/l))
• Mannitol hoặc glucose 20
• K2HPO4 0,2
• MgSO4.7H2O 0,2
• NaCl 0,2
•CaSO4 .2H2O 0,1
•CaCO3
• Nước cất vô đạm
vừa đủ 1 lít.
• pH 6,8-7
• Agar 15 -20
• 30 mẫu đất thu thập từ nhiều vùng đất chuyên canh rau màu.
• Hóa chất:
• crystal violet
• lugal
• safranin
• Dầu xem kính
• thạch dinh dưỡng BHI
• Glycerol
• Thuốc thử Nessler
• Thuốc thử Salkowski
• Canh tryptone
• H2O2 30%, đệm phosphate pH 7,0
2.Các bước tiến hành
• Thí nghiệm 1: Phân lập Azotobacter từ nhiều mẫu đất khác nhau.
-Pha loãng mẫu.
-Cấy mẫu.
•Thí nghiệm 2: Xác định đặc điểm hình thái khuẩn lạc
-Hình dạng khuẩn lạc
-Nhuộm gram
-Khả năng di chuyển trong thạch mềm.
-Quan sát hình dạng tế bào dưới kình hiển vi
•Thí nghiệm 3: Kiểm tra sinh hoá
-Thử catalase: Azotobacter cho kết quả dương tính
-Tuyển chọn các chủng VK cố định nitơ mạnh:Saukhi sơ tuyển được các chủng Azotobacter cố định nitơ, tiếp tục tuyển chọn các chủng có khả năng cố định nitơ mạnh dựa vào phản ứng màu với thuốc thử Nessler.(Thuốc thử Nessler là kali mercuri iodua K2HgI4 trong dung dịch kiềm)

-Xác định: Khả năng tổng hợp IAA thô khả năng tổng hợpIAA thô của các chủng vi sinh vật theophương pháp Salkowski cải tiến.
•Thí nghiệm 4:
Nhân giống và giữ giống

- Nhân giống trong môi trường Ashby lỏng
- Giữ giống